Urlaub

So,

nachdem ich 3 Wochen Urlaub hatte, hoffe ich doch mal, dass ich bald wieder was hier schreiben kann.

Bisher nicht viel passiert, ausser das brav Immunfluoreszenz Bilder ausgewertet wurden.

Kolonie PCR

Was ist eine Kolonie PCR? - Eine ganz normale PCR; nur das eine Bakterien (oder Hefe) Kolonie, anstatt z. B. isoliertes Plasmid oder DNA, als Substrat eingesetzt wird.

Was kann man mit dieser Methode anstellen? - Zum Beispiel mal eben überprüfen, ob das potentiel in das Bakterium eingeschleuste Plasmid auch tatsächlich das Insert beinhaltet. Dies bedeutet, das nicht erst der Vektor isoliert und aufgereinigt werden muß. Auch braucht kein Probeverdau durchgeführt werden.

Wie setze ich nun eine solch umwerfende PCR an? - Ganz einfach: In das vorbereitete PCR Gemisch wird, mittels eines sterilen Zahnstochers, eine Bakterien-Kolonie transferiert und resuspendiert. Merke: Natürlich nur eine Kolonie pro Tube. :) Bei high-copy Plasmiden reichen natürlich nur einige, wenige Zellen. Ob es eine ganze Kolonie sein soll ist auch Glaubensfrage; da scheiden sich die Geister... ;)
Ansonsten ist diese Art der PCR nicht unterscheidbar von einer 'Normalen'. Also gelten auch hier diesselben Grundsätze!

Happy PCRing!

Professor Allolio wird 60 II

Der Tag danach... :)

War gut die Feier. Viele Reden, Musik, Spiele. Und leckeres Essen und Wein! Das Faßbier (Kauzen) war nicht gut.

Danach noch 1.5 Stunden nach Hause gegangen... :)

Professor Allolio wird 60

Nachdem diese Woche Herr Allolio 60 geworden ist, wurde ihm zu ehren ein Endokrinologie-Symposium von seinen Leuten organisiert, welches morgen stattfindet.

Eingeladen sind Leute, mit denen er früher zu tun gehabt hat und heutzutage hat. Gehe da auch hin. Wird bestimmt spannend und interessant. Abends ist lecker essen angesagt. Werden dann unseres Geprobtes aufführen. Wird bestimmt auch lustig.

Vielleicht übermorgen mehr.

Primer Design für Polymerase Ketten Reaktion

So, hier mal eine kurze Einführung wie man ordinäre Primer für Polymerase Ketten Reaktion (PCR) erstellt und die Annealing Temperatur berechnen kann.

-- Ein Standard Primer hat eine Länge von ca. 15-18 Nukleotide.

-- Die Annealing Temperatur (Ta) liegt zwischen 50 °C und 75 °C. Berechnet wird Ta nach folgender Formel:

• Ta = 69,3 + 0,41 * (% GC) - (650 / Länge Oligo) bzw.
• Ta = [(A / T) * 2] + [(G / C) * 4) -5.

Wobei A = Adenosin, T = Thymidin, G = Guanosin, C = Deoxycytidin, Länge Oligo die Länge des Primers und % GC den prozentualen Guanosin/Deoxycytidin-Gehalt darstellt.

-- Beginnen und Enden sollte der Primer mit GC-Paaren, da diese Paarungen 3 Wasserstoffbrückenbindungen (WBB) miteinander ausbilden, währen AT-Paare nur 2 WBB aufzeigen. Durch die 3 WBB bindet der Primer stärker an seine komplementären Loci, wodurch mismatch Paarungen und somit fehlerhafte Replikate reduziert werden.

-- Weiterhin muß sichergestellt werden, das der jeweilige Primer mit sich selbst keine Sekundärstrukturen ausbildet und beide Primer keine Dimere miteinander bilden.

Wofür das Ganze? Über die Primer werden mittels PCR (s. u.) z. B. Gene amplifiziert, gewünschte Restriktionsschnittstellen und Mutationen (z. B. über QuikChange Mutagenese) eingeführt.

Immunhistochemie mit Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten Gewebe II

Die Antigen Retrieval Methode hier ist nun die Mikrowelle. Für eine Hintergrund-Beschreibung der Immunhistochemie (IHC) siehe das vorherige Posting. :)

Protokoll:
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- Deparaffination für jeweils 10 min. in Xylol.

- Rehydrierung für jeweils 10 min. in EtOH und dessen Verdünnungen.

- AR mit einer Mikrowelle. Schnitte in 10 mM Citratmonohydrat-Puffer pH6 2x 5 min. aufkochen. Zwischen den Schritten verdunsteten Puffer nachfüllen.

- Ca. 25 min. abkühlen lassen.

- 5x Spülen mit aqua dest.

- Hemmung der endogenen Peroxidase mit 3 % H2O2 in MeOH für 10 min. bei Raumtemperatur (RT).

- Spülen mit Leitungswasser und aqua dest.

- Proteinblock für 1 Stunde bei RT (manche blocken garnicht, andere bevorzugen andere Inkubationszeiten. Testet es selber aus).

- Inkubation der Schnitte mit primärem Antikörper bzw. Negativkontrolle. (Optimale Inkubationszeit müßt Ihr selber austesten). Das Serum nur Abkippen. Das verbleibende Serum kann die Hintergrundfärbung verringern.

- Gut waschen mit PBS.

- Detektion des Antikörpers mit einem System Eurer Wahl. Ich benutze ein Peroxidase System aus Meerrettich(HRP), auf welches sich auch das weitere Vorgehen bezieht. Favorisiert Ihr ein Anderes müßt Ihr Euch selber schlau machen. :) 30 min. inkubieren bei RT.

- Gut waschen mit PBS.

- Substrat (DAB/Novared) für 10 min. bei RT.

- Waschen. Erst Leitungswasser, dann aqua dest.

- Kernfärbung für 2 min. bei RT in Hämalaun nach Meyer.

- Bläuen für 5 min. in reichlich Leitungswasser. Soll die Farbe intensivieren (diese Aussage ist Glaubensfrage).

- Schnitte kurz in 100 % EtOH baden.

- Trocknen für ca. 20 min. bei 56 °C. 30 min. bei 37 °C reichen auch.

- Schnitte Eindecken.

Fertig!