Kolonie PCR

Was ist eine Kolonie PCR? - Eine ganz normale PCR; nur das eine Bakterien (oder Hefe) Kolonie, anstatt z. B. isoliertes Plasmid oder DNA, als Substrat eingesetzt wird.

Was kann man mit dieser Methode anstellen? - Zum Beispiel mal eben überprüfen, ob das potentiel in das Bakterium eingeschleuste Plasmid auch tatsächlich das Insert beinhaltet. Dies bedeutet, das nicht erst der Vektor isoliert und aufgereinigt werden muß. Auch braucht kein Probeverdau durchgeführt werden.

Wie setze ich nun eine solch umwerfende PCR an? - Ganz einfach: In das vorbereitete PCR Gemisch wird, mittels eines sterilen Zahnstochers, eine Bakterien-Kolonie transferiert und resuspendiert. Merke: Natürlich nur eine Kolonie pro Tube. :) Bei high-copy Plasmiden reichen natürlich nur einige, wenige Zellen. Ob es eine ganze Kolonie sein soll ist auch Glaubensfrage; da scheiden sich die Geister... ;)
Ansonsten ist diese Art der PCR nicht unterscheidbar von einer 'Normalen'. Also gelten auch hier diesselben Grundsätze!

Happy PCRing!

DNA Isolation

Hier soll Euch kurz vorgestellt werden, wie man Deoxyribonukleinsäure (DNA) aus Gewebe isolieren und aufreinigen kann. Auch soll versucht werden die Hintergründe zu erklären.

Zuallererst: DNA ist ein Polyanion. Das heißt sie besitzt viele (poly) negative Ladungen (Anionen sind negativ geladene Moleküle).

Prinizipiell kann sie mittels 2 verschiedener Arten isoliert werden:

-- käuflich zu erwerbenes Kit (kann jeder),
-- nach selbst zusammengestellten Protokollen (kann auch jeder).

Ich persönlich finde die DNA-Isolierung durch nicht-Kits um einiges besser, da man doch eigentlich wissen sollte was man gerade anstellt bzw. was für Chemikalien man benutzt. Bei Kits schwebt man doch häufig in Unwissenheit...

Auch kann ich bei eigenen Protokollen händisch bestimmen was ich für Reagenzien einsetze, z. B. bin ich kein sonderlicher Freund des Chloroforms, Isoamylalkohol und ähnlichen organischen Schlonz. Sind ja nicht sonderlich gesundheitsfreundlich. ;)

Was also tun? Nach bißchen Literaturrecherche kann man sehr simple Protokolle finden, die sich natürlich auch kombinieren lassen. Diese dann austesten muß/sollte man natürlich auch (wie ist Ausbeute, Reinheit, etc.).

Zum Beispiel läßt sich DNA flugs mittels Natronlauge (NaOH), schnödes Kochsalz (NaCl), Ethanol (EtOH) und Isopropylalkohol aus Gewebe isolieren und aufreinigen. Kurz gefasst:

-- Gewebe mittels NaOH zerstören bei 100 °C.
-- Kurzzeitiges Abkühlen der Lösung auf Eis.
-- Proteine aussalzen mit NaCl. Hier werden die Proteine über die Salzionen verbunden und können abzentrifugiert werden.
-- DNA mit Isopropylalkohol fällen. Der Alkohol verdrängt die Wassermoleküle, so daß die positiven Salzionen (Na+) kovalente Bindungen (statt der sonst nur Ionischen) mit den Sauerstoffatomen der Phosphate ausbilden können und die Nukleinsäure somit elektrisch neutralisiert wird und ausfällt. Man kann auch für minimal 1 h bei -20 °C fällen. Dies kann zu erhöhter Ausbeute führen.
-- Abzentrifugieren der Nukleinsäure.
-- Waschen mit 100 % EtOH.
-- Waschen mit 75 % EtOH (die beiden Waschschritte entfernen unnötige Salze).
-- Abzentrifugieren.
-- Das Pellet für 10-15 min. bei 37 °C trocknen. Nicht übertrockenen!
-- Pellet in einem geeignetem Volumen aufnehmen. Manche favorisieren Wasser, Andere Tris-EDTA (TE) -Puffer. Vorteil des Puffers ist, das die DNA länger stabil bleiben sollte.
-- Lagerung der Nukleinsäure. Kurzfristig bei - 20 °C, Langzeit bei -80 °C.

Die Reinheit der DNA sollte zwischen 1.8 und 2.0 liegen (Extinktion von 260/280) und auch bei 260/230. Ersteres gibt proteinale Verunreinigungen an, zweiteres welche durch Kohlenhydrate.

So, viel Spaß hiermit und beim Austesten eigener Protokolle! :)