Selbstgebastelte Sonden für FISH

Hier ein Protokoll zum selberbasteln für FISH Sonden. Als erstes muß die Grundlage des Versuches geschaffen werden, das Sondenbasteln an sich. Hierfür können Vektoren gekauft werden (in Bakterien-Stämmen), die das gewünschte Gensegment bzw. den chromosomalen Bereich umfassen. Nach Anzucht der Stämme und Isolierung der Plasmide (händisch bzw. per Kit und Konzentrationsbestimmung der Plasmid-DNA) kann losgelegt werden.

Ich hatte für das Sondenbasteln ein Kit benutzt, und zwar das Biotin-16-dUTP 5' dNTP Kit von Roche nach deren Protokoll. Hierbei werden 1 µg template DNA auf ein Volumen von 16 µl gebracht (mit Aqua destillata) und 4 µl Biotin-Nick Translation Mix zugegeben, gemixt und kurz abzentrifugiert. Anschließend wird eine 90 minütige Inkubation bei 15 °C durchgeführt und die Reaktion durch Zugabe von 1 µl EDTA-Lösung gestoppt und die Enzyme durch eine 10 minütige Inkubation bei 65 °C inaktiviert. Im Anschluß wird eine Gel-Elektrophorese durchgeführt (mit 3 µl Assay) um zu überprüfen, ob die enzymatisch generierten Plasmid-DNA Fragmente eine Größe von 200-500 Nukleotide haben. Ist dies nicht der Fall muss erneut inkubiert werden, ansosnten wird die DNA aufgereinigt (per Hand oder Kit) und die FISH-Analyse kann durchgeführt werden (folgt später).

Auch können die Sonden komplett selbst gebastelt werden, was ich eventuell in einem späteren Post beschreiben werde.