Kolonie PCR

Was ist eine Kolonie PCR? - Eine ganz normale PCR; nur das eine Bakterien (oder Hefe) Kolonie, anstatt z. B. isoliertes Plasmid oder DNA, als Substrat eingesetzt wird.

Was kann man mit dieser Methode anstellen? - Zum Beispiel mal eben überprüfen, ob das potentiel in das Bakterium eingeschleuste Plasmid auch tatsächlich das Insert beinhaltet. Dies bedeutet, das nicht erst der Vektor isoliert und aufgereinigt werden muß. Auch braucht kein Probeverdau durchgeführt werden.

Wie setze ich nun eine solch umwerfende PCR an? - Ganz einfach: In das vorbereitete PCR Gemisch wird, mittels eines sterilen Zahnstochers, eine Bakterien-Kolonie transferiert und resuspendiert. Merke: Natürlich nur eine Kolonie pro Tube. :) Bei high-copy Plasmiden reichen natürlich nur einige, wenige Zellen. Ob es eine ganze Kolonie sein soll ist auch Glaubensfrage; da scheiden sich die Geister... ;)
Ansonsten ist diese Art der PCR nicht unterscheidbar von einer 'Normalen'. Also gelten auch hier diesselben Grundsätze!

Happy PCRing!

Primer Design für Polymerase Ketten Reaktion

So, hier mal eine kurze Einführung wie man ordinäre Primer für Polymerase Ketten Reaktion (PCR) erstellt und die Annealing Temperatur berechnen kann.

-- Ein Standard Primer hat eine Länge von ca. 15-18 Nukleotide.

-- Die Annealing Temperatur (Ta) liegt zwischen 50 °C und 75 °C. Berechnet wird Ta nach folgender Formel:

• Ta = 69,3 + 0,41 * (% GC) - (650 / Länge Oligo) bzw.
• Ta = [(A / T) * 2] + [(G / C) * 4) -5.

Wobei A = Adenosin, T = Thymidin, G = Guanosin, C = Deoxycytidin, Länge Oligo die Länge des Primers und % GC den prozentualen Guanosin/Deoxycytidin-Gehalt darstellt.

-- Beginnen und Enden sollte der Primer mit GC-Paaren, da diese Paarungen 3 Wasserstoffbrückenbindungen (WBB) miteinander ausbilden, währen AT-Paare nur 2 WBB aufzeigen. Durch die 3 WBB bindet der Primer stärker an seine komplementären Loci, wodurch mismatch Paarungen und somit fehlerhafte Replikate reduziert werden.

-- Weiterhin muß sichergestellt werden, das der jeweilige Primer mit sich selbst keine Sekundärstrukturen ausbildet und beide Primer keine Dimere miteinander bilden.

Wofür das Ganze? Über die Primer werden mittels PCR (s. u.) z. B. Gene amplifiziert, gewünschte Restriktionsschnittstellen und Mutationen (z. B. über QuikChange Mutagenese) eingeführt.