Kolonie PCR

Was ist eine Kolonie PCR? - Eine ganz normale PCR; nur das eine Bakterien (oder Hefe) Kolonie, anstatt z. B. isoliertes Plasmid oder DNA, als Substrat eingesetzt wird.

Was kann man mit dieser Methode anstellen? - Zum Beispiel mal eben überprüfen, ob das potentiel in das Bakterium eingeschleuste Plasmid auch tatsächlich das Insert beinhaltet. Dies bedeutet, das nicht erst der Vektor isoliert und aufgereinigt werden muß. Auch braucht kein Probeverdau durchgeführt werden.

Wie setze ich nun eine solch umwerfende PCR an? - Ganz einfach: In das vorbereitete PCR Gemisch wird, mittels eines sterilen Zahnstochers, eine Bakterien-Kolonie transferiert und resuspendiert. Merke: Natürlich nur eine Kolonie pro Tube. :) Bei high-copy Plasmiden reichen natürlich nur einige, wenige Zellen. Ob es eine ganze Kolonie sein soll ist auch Glaubensfrage; da scheiden sich die Geister... ;)
Ansonsten ist diese Art der PCR nicht unterscheidbar von einer 'Normalen'. Also gelten auch hier diesselben Grundsätze!

Happy PCRing!

Professor Allolio wird 60 II

Der Tag danach... :)

War gut die Feier. Viele Reden, Musik, Spiele. Und leckeres Essen und Wein! Das Faßbier (Kauzen) war nicht gut.

Danach noch 1.5 Stunden nach Hause gegangen... :)

Professor Allolio wird 60

Nachdem diese Woche Herr Allolio 60 geworden ist, wurde ihm zu ehren ein Endokrinologie-Symposium von seinen Leuten organisiert, welches morgen stattfindet.

Eingeladen sind Leute, mit denen er früher zu tun gehabt hat und heutzutage hat. Gehe da auch hin. Wird bestimmt spannend und interessant. Abends ist lecker essen angesagt. Werden dann unseres Geprobtes aufführen. Wird bestimmt auch lustig.

Vielleicht übermorgen mehr.

Primer Design für Polymerase Ketten Reaktion

So, hier mal eine kurze Einführung wie man ordinäre Primer für Polymerase Ketten Reaktion (PCR) erstellt und die Annealing Temperatur berechnen kann.

-- Ein Standard Primer hat eine Länge von ca. 15-18 Nukleotide.

-- Die Annealing Temperatur (Ta) liegt zwischen 50 °C und 75 °C. Berechnet wird Ta nach folgender Formel:

• Ta = 69,3 + 0,41 * (% GC) - (650 / Länge Oligo) bzw.
• Ta = [(A / T) * 2] + [(G / C) * 4) -5.

Wobei A = Adenosin, T = Thymidin, G = Guanosin, C = Deoxycytidin, Länge Oligo die Länge des Primers und % GC den prozentualen Guanosin/Deoxycytidin-Gehalt darstellt.

-- Beginnen und Enden sollte der Primer mit GC-Paaren, da diese Paarungen 3 Wasserstoffbrückenbindungen (WBB) miteinander ausbilden, währen AT-Paare nur 2 WBB aufzeigen. Durch die 3 WBB bindet der Primer stärker an seine komplementären Loci, wodurch mismatch Paarungen und somit fehlerhafte Replikate reduziert werden.

-- Weiterhin muß sichergestellt werden, das der jeweilige Primer mit sich selbst keine Sekundärstrukturen ausbildet und beide Primer keine Dimere miteinander bilden.

Wofür das Ganze? Über die Primer werden mittels PCR (s. u.) z. B. Gene amplifiziert, gewünschte Restriktionsschnittstellen und Mutationen (z. B. über QuikChange Mutagenese) eingeführt.

Immunhistochemie mit Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten Gewebe II

Die Antigen Retrieval Methode hier ist nun die Mikrowelle. Für eine Hintergrund-Beschreibung der Immunhistochemie (IHC) siehe das vorherige Posting. :)

Protokoll:
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- Deparaffination für jeweils 10 min. in Xylol.

- Rehydrierung für jeweils 10 min. in EtOH und dessen Verdünnungen.

- AR mit einer Mikrowelle. Schnitte in 10 mM Citratmonohydrat-Puffer pH6 2x 5 min. aufkochen. Zwischen den Schritten verdunsteten Puffer nachfüllen.

- Ca. 25 min. abkühlen lassen.

- 5x Spülen mit aqua dest.

- Hemmung der endogenen Peroxidase mit 3 % H2O2 in MeOH für 10 min. bei Raumtemperatur (RT).

- Spülen mit Leitungswasser und aqua dest.

- Proteinblock für 1 Stunde bei RT (manche blocken garnicht, andere bevorzugen andere Inkubationszeiten. Testet es selber aus).

- Inkubation der Schnitte mit primärem Antikörper bzw. Negativkontrolle. (Optimale Inkubationszeit müßt Ihr selber austesten). Das Serum nur Abkippen. Das verbleibende Serum kann die Hintergrundfärbung verringern.

- Gut waschen mit PBS.

- Detektion des Antikörpers mit einem System Eurer Wahl. Ich benutze ein Peroxidase System aus Meerrettich(HRP), auf welches sich auch das weitere Vorgehen bezieht. Favorisiert Ihr ein Anderes müßt Ihr Euch selber schlau machen. :) 30 min. inkubieren bei RT.

- Gut waschen mit PBS.

- Substrat (DAB/Novared) für 10 min. bei RT.

- Waschen. Erst Leitungswasser, dann aqua dest.

- Kernfärbung für 2 min. bei RT in Hämalaun nach Meyer.

- Bläuen für 5 min. in reichlich Leitungswasser. Soll die Farbe intensivieren (diese Aussage ist Glaubensfrage).

- Schnitte kurz in 100 % EtOH baden.

- Trocknen für ca. 20 min. bei 56 °C. 30 min. bei 37 °C reichen auch.

- Schnitte Eindecken.

Fertig!

Immunhistochemie mit Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten Gewebe I

So, hier mal ein Immunhistochemie (IHC) -Protokoll, das als Antigen Retrieval (AR) die Protease Trypsin einsetzt. Die Gewebe sind Formalin-fixiert und Paraffin-eingebettet, was eine Lagerung von mehreren Jahrzehnten ermöglicht. Die Lagerung erfolgt natürlich möglichst unter kühlen und trockenen Bedingungen; sowie als Gesamtblock und nicht als einzelner Schnitt.

Hintergrund:
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Nachdem das entsprechende Gewebe mit Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet wurde, kann es bei Bedarf mittles eines Mikrotomes in Schnitte mit wenigen Mikrometer Dicke gebracht und auf Objektivträger überführt werden.

Bevor man mit diesen so für lange Zeit haltbar gemachten Gewebe arbeiten kann, muß zuerst das Wachs entfernt und der Schnitt rehydriert werden. Die Deparaffination wird mit dem Alkohol Xylen erreicht. Die Rehydrierung findet mittels 100 % Ethanol (EtOH) und mit aqua destillata (Aqua dest) verdünnten EtOH statt.

Das Trypsin verdaut (natürlich nach Deparaffination und Rehydrierung) teilweise die Gewebematrix bzw. das Gewebe und führt somit zur Verfügbarkeit des potentiellen Antigens. Das kann man sich in etwas so vorstellen, das die besagte Protease (ein solches Enzym 'zerschneidet' Proteine) Löcher in die Zellwand und in das innere der Zellen 'schneidet'. Durch dieses Löchern können dann die verwendeten Antikörper, Enzyme und weitere Substanzen in die Zellen eindringen.

Als nächstes findet die Hemmung der endogenen Peroxidase mittels 3 % Wasserstoffperoxidlösung (H2O2) in Methanol (MeOH) statt. Dies kann zu einer Reduktion des Hintergrundsignales bei der Farbentwicklung führen.

Bevor nun der Antikörper zugegeben wird, sollte noch möglichst ein Proteinblock mit einem dem verwendeten Gewebe entsprechendem Serum durchgeführt werden, was in einer Herabsetzung der unspezifischen Antikörperbindung resultieren kann.

Als nächstes wird der entsprechende Antikörper zugegeben und nach einer vorher bestimmten Inkubationszeit abgewaschen. Die Negativkontrolle dient natürlich zur Evaluation der Spezifität des Antikörpers. Gibt es bei Negativkontrolle ein Farbsignal habt Ihr nicht genug geblockt, unsauber gearbeitet, Antikörper 'verschleppt', der Antikörper ist nicht spezifisch usw.

Hiernach findet die Detektion des Antikörpers statt und es wird (mit dem System der Wahl) eine Farbgebung herbei geführt. Zum Schluß wird nur noch der Schnitt getrocknet und mit z. B. Entellan und einem Objektivträger eingedeckt.

Aber hier nun das Protokoll, welches etwas allgemein gehalten ist, da jeder seine Präferenzen hat. Fragt nach, oder benutzt eine Suchmaschine Eurer Wahl!

Protokoll:
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- Deparaffination für jeweils 10 min. in Xylol.

- Rehydrierung für jeweils 10 min. in EtOH und dessen Verdünnungen.

- AR mit 0.05 % Endkonzentration Trypsin (Dauer richtet sich häufig nach jeweiligem Antikörper und Firma) bei 37 °C. Ich inkubiere 10 min.

-Waschen mit Leitungswasser für 3 min. und kurzes Spülen mit aqua dest.

- Hemmung der endogenen Peroxidase mit 3 % H2O2 in MeOH für 10 min. bei Raumtemperatur (RT).

- Spülen mit Leitungswasser und aqua dest.

- Proteinblock für 1 Stunde bei RT (manche blocken garnicht, andere bevorzugen andere Inkubationszeiten. Testet es selber aus).

- Inkubation der Schnitte mit primärem Antikörper bzw. Negativkontrolle. (Optimale Inkubationszeit müßt Ihr selber austesten). Das Serum nur Abkippen. Das verbleibende Serum kann die Hintergrundfärbung verringern.

- Gut waschen mit PBS.

- Detektion des Antikörpers mit einem System Eurer Wahl. Ich benutze ein Peroxidase System aus Meerrettich(HRP), auf welches sich auch das weitere Vorgehen bezieht. Favorisiert Ihr ein Anderes müßt Ihr Euch selber schlau machen. :) 30 min. inkubieren bei RT.

- Gut waschen mit PBS.

- Substrat (DAB/Novared) für 10 min. bei RT.

- Waschen. Bei DAB erst Leitungswasser, dann aqua dest. Bei Novared nur aqua dest.

- Kernfärbung für 2 min. bei RT in Hämalaun nach Meyer.

- Bläuen für 5 min. in reichlich Leitungswasser. Soll die Farbe intensivieren (diese Aussage ist Glaubensfrage).

- Schnitte kurz in 100 % EtOH baden.

- Trocknen für ca. 20 min. bei 56 °C. 30 min. bei 37 °C reichen auch.

- Schnitte Eindecken.

Fertig!

Laborumzug III

Fertig Umgezogen (seid ca. 1 Woche)! Und brav wieder am Arbeiten... ;)

Ist eigentlich auch garnicht so wild gewesen. Natürlich öffnet man/ich immernoch einige Schränke zigmal auf der Suche nach einigen Utensilien, aber das sollte sich auch noch legen.

An sich ist es garnicht schlecht hier. Aus dem Denkraum kann man Anderen beim Arbeiten zuschauen und wenn man selber Arbeitet hat man auch einen, teilweise, netten Ausblick. :)

So, jetzt wieder weg...

Laborumzug II

So, nächste Woche sind wir dran mit unserem Umzug. Da diese Woche die Routine umgezogen ist, haben wir uns da teilweise mit eingeklemmt. Soll heißen, das schon brav Zeugs ins ZIM transportiert wurde. Somit ist nächste Woche nicht mehr allzuviel zu packen. Umziehen wird von einer Firma erledigt.

Apropos ZIM, unsere Labore sind dann auf Ebene -3. Zum Glück ist das ebenerdig. Somit haben bzw. sehen wir auch natürliches Licht und nicht nur Künstliches. :) Als Schlüssel gibt es für einige Türen Mechanische (wie z. B. für das WC) und für alle anderen Türen einen Transponder, welcher so programmiert wird, das man nur Eintritt in die Türen erhält, in die man auch soll/darf/muß.

Nach dem kompletten Umzug und Einräumen wieder mehr.

Laborumzug I

So, der Laborumzug rückt immer näher. Alle sind teilweise bzw. mehr oder weniger gestresst. Ich hänge da zum Glück so gut wie garnicht drinnen... :) Aber es wird viel gestöhnt... Das kann etwas nervig sein.

In den Räumlichkeiten war ich auch noch nicht. Hatte immer was zu tun, wenn die Anderen dorthin aufgebrochen sind. Sollte das (k)ein Zufall sein... Verschwörungstheorien sind überall...

Aber ich weiß jetzt schon, was mir nicht paßt (sollte es tatsächlich so sein): man sitzt im Labor, und der Aufenthaltsraum soll relativ weit weg sein. Das ist doof, da ich zu den Leuten gehöre, die regelmäßig und relativ viel trinken (müssen), damit sie nicht ungehalten werden bzw. Kopfschmerzen bekommen bzw. denken können... Naja, mal sehen, was so wirklich bei rum kommt.

Und man darf Mitarbeiter-Schulungen machen. Das ist nicht verkehrt, weiß ich, da man dort hoffentlich ordentlich Infos bekommt. Im Moment ist es so, das viele nur wenig wissen. Naja...

DNA Isolation

Hier soll Euch kurz vorgestellt werden, wie man Deoxyribonukleinsäure (DNA) aus Gewebe isolieren und aufreinigen kann. Auch soll versucht werden die Hintergründe zu erklären.

Zuallererst: DNA ist ein Polyanion. Das heißt sie besitzt viele (poly) negative Ladungen (Anionen sind negativ geladene Moleküle).

Prinizipiell kann sie mittels 2 verschiedener Arten isoliert werden:

-- käuflich zu erwerbenes Kit (kann jeder),
-- nach selbst zusammengestellten Protokollen (kann auch jeder).

Ich persönlich finde die DNA-Isolierung durch nicht-Kits um einiges besser, da man doch eigentlich wissen sollte was man gerade anstellt bzw. was für Chemikalien man benutzt. Bei Kits schwebt man doch häufig in Unwissenheit...

Auch kann ich bei eigenen Protokollen händisch bestimmen was ich für Reagenzien einsetze, z. B. bin ich kein sonderlicher Freund des Chloroforms, Isoamylalkohol und ähnlichen organischen Schlonz. Sind ja nicht sonderlich gesundheitsfreundlich. ;)

Was also tun? Nach bißchen Literaturrecherche kann man sehr simple Protokolle finden, die sich natürlich auch kombinieren lassen. Diese dann austesten muß/sollte man natürlich auch (wie ist Ausbeute, Reinheit, etc.).

Zum Beispiel läßt sich DNA flugs mittels Natronlauge (NaOH), schnödes Kochsalz (NaCl), Ethanol (EtOH) und Isopropylalkohol aus Gewebe isolieren und aufreinigen. Kurz gefasst:

-- Gewebe mittels NaOH zerstören bei 100 °C.
-- Kurzzeitiges Abkühlen der Lösung auf Eis.
-- Proteine aussalzen mit NaCl. Hier werden die Proteine über die Salzionen verbunden und können abzentrifugiert werden.
-- DNA mit Isopropylalkohol fällen. Der Alkohol verdrängt die Wassermoleküle, so daß die positiven Salzionen (Na+) kovalente Bindungen (statt der sonst nur Ionischen) mit den Sauerstoffatomen der Phosphate ausbilden können und die Nukleinsäure somit elektrisch neutralisiert wird und ausfällt. Man kann auch für minimal 1 h bei -20 °C fällen. Dies kann zu erhöhter Ausbeute führen.
-- Abzentrifugieren der Nukleinsäure.
-- Waschen mit 100 % EtOH.
-- Waschen mit 75 % EtOH (die beiden Waschschritte entfernen unnötige Salze).
-- Abzentrifugieren.
-- Das Pellet für 10-15 min. bei 37 °C trocknen. Nicht übertrockenen!
-- Pellet in einem geeignetem Volumen aufnehmen. Manche favorisieren Wasser, Andere Tris-EDTA (TE) -Puffer. Vorteil des Puffers ist, das die DNA länger stabil bleiben sollte.
-- Lagerung der Nukleinsäure. Kurzfristig bei - 20 °C, Langzeit bei -80 °C.

Die Reinheit der DNA sollte zwischen 1.8 und 2.0 liegen (Extinktion von 260/280) und auch bei 260/230. Ersteres gibt proteinale Verunreinigungen an, zweiteres welche durch Kohlenhydrate.

So, viel Spaß hiermit und beim Austesten eigener Protokolle! :)

Polymerasekettenreaktion einfach erklärt

Nachdem die Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction; PCR) durch das Heilbronner Phantom in - mehr oder weniger - aller Munde ist, möchte ich hier mal erklären, was es mit dieser tollen Methode auf sich hat.

Die Grundlage der PCR ist das Vorhandensein von Deoxyribonukleinsäure (DNA). Mit DNA als Substrat kann mittels spezifischen Primern (diese geben den Start- und Endbereich des zu amplifizierenden [verfielfältigenden] Bereiches der PCR-Reaktion an. Auch bei den Primern handelt es sich um kurze Sequenzen von Nukleinsäure) ein bestimmter Bereich der DNA vervielfältigt werden. Dies ist möglich, da die Primer nur an ihnen komplementären (d.h. ähnlichen) Bereichen binden (das sogenannte Annealing). Die Spezifität des Annealing wird duch die Primer-spezifische Annealing-Temperatur (Tm) ermöglicht. Die Tm wiederum ergibt sich aus der jeweiligen Sequenz des Primers. Mit einem speziellen Gerät, der PCR (-Maschine) kann nun z. B. überprüft werden, ob durch die Primer definierte DNA-Abschnitte vorhanden sind.

Wie funktioniert dies aber genau??? - Das ist (relativ) einfach.

Doppelsträngige DNA (dsDNA; siehe Abbildung) setzt sich aus vier an Zucker (Deoxyribose) gebundene Basen zusammen: Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin. Diese Nukleoside werden dann (Deoxy-) Adenosin (A), (Deoxy-) Guanosin (G), (Deoxy-) Cytidin (C) und (Deoxy-) Thymidin (T) genannt. Das Rückgrat der DNA besteht aber aus Zucker-Phosphat (die gewundenen 'Bänder' in der Abbildung). Die 'nun' phosphorylierten Nukleoside werden Nukleotide (hier nicht gezeigt) genannt. Lagern sich jeweils einzelne (ss) zueinander komplementäre DNA-Stränge aneinander, resultiert dsDNA (die Gesamtstruktur in der Abbildung). Die einzelnen Basen bilden dann Paare aus, und zwar immer A mit T und G mit C (siehe Abbildung).

Eine DNA-Polymerase ist ein Enzym (ein Protein, das als Katalysator dient), welches in der Lage ist DNA zu amplifizieren. Allerdings brauchen DNA-Polymerasen ein schon vorhandenes DNA-Ende um ihre Funktion auszuüben bzw. überhaupt zu beginnen. Fehlt dies kann sie ihre Arbeit nicht ausführen. Diese Enzyme besitzen alle Lebewesen. Für die PCR werden meist Proteine aus bestimmten thermophilen (hitzeliebende) Bakterien benutzt, da diese die hohen Temperaturen, die bei der PCR zutrage kommen, 'verkraften'.

Ein PCR-Ansatz setzt sich aus folgenden Bestandteilen zusammen: DNA, Deoxynukleotide (dNTPs), destilliertes Wasser, Primer, eine Polymerase und ein der Polymerase entsprechendes Puffersystem. Als erstes wird die dsDNA zu ssDNA durch hohe Temperaturen (95 °C) 'aufgeschmolzen'. Durch das Absenken der Temperatur auf die Tm können sich die Primer an ihnen komplementären Bereichen anlagern. Durch die annealten Primer ist die Polymerase in der Lage diese bestimmten Bereiche zu vervielfältigen. Die Amplifikation geschieht meist bei 72 °C (die Extensionsphase), ist aber auch von der Polymerase selbst abhängig (je nachdem welche Temperatur für sie optimal ist). Durch das mehrmalige Wiederholen dieses Vorganges kann aus sehr wenig vorliegender DNA ein 'gutes Stück Material' erhalten werden, welches zur Sequenzierung (Bestimmung der T, G, A und C Abfolge) verwendet werden kann.

Bei einer guten PCR wird eigentlich immer eine Negativkontrolle mit verwendet. Diese Kontrolle enthält alles außer der DNA (bei selben Volumen des Ansatzes) und dient der Bestimmung, ob sich irgendwo Verunreinigungen eingeschlichen haben. Die Differenz aus fehlender DNA wird mit destillierten Wasser ausgeglichen. Die Negativkontrolle ist im Optimalfall selbstredend negativ.

Zu beachten ist, das man nicht zuviel DNA und zuwenig Primer zugibt. Dies führt dazu, das die Primer bei späteren Zyklen nicht mehr für die PCR verfügbar sind; sie haben sich ja schon an die DNA angelagert und stehen somit späteren amplifizierten Produkten nicht mehr zur Verfügung. Somit findet keine/kaum noch Amplifizierung statt. Für gewöhnlich setzt man 10-100 ng DNA pro Ansatz ein. Auch sind zuviele dNTPs der PCR nicht zuträglich, da sie die Polymerase inhibieren können. 20-50 pmol beider Primer sind gewöhnlich ausreichend. Eine zu großzügig gewählte Anzahl an Zyklen ist auch unerwünscht, da man Gefahr laufen kann 'Schrott' (oder alles andere außer dem Gewünschten) zu amplifizieren. Als Startzahl genügen 30-35 Zyklen. Mehr als 45 Zyklen sollte man sich überlegen. Zuviel Polymerase ist auch unsinnig, da man so den gefürchteten Schmier (abgebrochene Transkripte) begünstigt. Weniger an Enzym ist meist mehr. Weiterhin kann die PCR mit Zusätzen wie z. B. Rinderserumalbumin (BSA), Mg++ Ionen und Dimethylsulfoxid (DMSO) optimiert werden. Das BSA kann die Wände der Reaktionsgefäße auskleiden, so daß die Polymerase nicht an den Wänden bindet und somit der PCR-Reaktion zur Verfügung steht. Die Mg++ Ionen beinflussen das Primer-Annealing ('überbrücken' der negativen Ladungen der polyanionischen Nukleinsäuren), das Denaturierungsverhalten der DNA (selbige Grund wie eben), die Enzymaktivität (Enzyme sind meist Mg++ abhängig), die Genauigkeit und können Primer-Dimer Artefakte begünstigen (siehe Ladung). Ebenso können sie das unspezifische Binden von Primern begünstigen. Das DMSO fördert das Denaturieren der DNA. DMSO ist wie DNA negativ geladen. Es kann somit das Schmelzverhalten der DNA beinflussen, was sich positiv auf die Amplifikation von GC-reichen Sequenzen ausüben kann. Weiterhin destabilisiert DMSO auch ein wenig das Enzym.

So, ich hoffe ich konnte etwas die PCR erklären bzw. paar Tips geben. Wie immer: ihr könnt die Kommentare nutzen...

Quelle des Bildes: http://www.medizin.uni-tuebingen.de/webim2/moldiag/bilder/dna.jpg

Immunhistochemie (IHC) Etablierung

So, nachdem es so scheint, das die IHC für den benutzten Antikörper etabliert ist, wurden auch schon die ersten Nebennieren-Karzinome (ACC) gefärbt. Nix... Leider sind es auch keine so wundervollen Schnitte. Sie bestehen hauptsächlich aus Fett- bzw. Stroma-Gewebe und dies ist halt negativ für das Antigen (auch in der Literatur ;) ).

Antigen Retrieval mache ich hier mit Trypsin bei 37 °C. Citratmonohydrat-Puffer (pH 6) und Hitze (Druckkochtopf; 10 und 20 min.) läßt die Schnitte fast wie eine 'Milka-Kuh' aussehen. Und das ist ziemlich uncool... Mit Protease ist aber alles gut. Auch kann man ordentliche Verdünnung (1:1000) benutzen. *g*

Wenigstens waren Positiv- und Negativkontrollen so wie sie sein sollten... :)

Außerdem ist die Gegenfärbung voll für den *****. Mal neues Hämalaun nach Mayer benutzen.

Bei Gelegenheit schreibe ich welche Protokolle ich (momentan) benutze.

In diesem Sinne!

Überblick über das Immunsystem

Heute soll hier eine kurze Einführung über das Immunsystem auftauchen. Was die jeweiligen Zellen so bewirken (können) soll zu einer anderen Zeit hier erscheinen.

Das Immunsystem (IS) kann folgend unterteilt werden:
- zelluläres IS
- humorales IS
- Complement System.

Immunität wird durch Leukozyten vermittelt, die in Zellen des angeborenen IS und des adaptiven IS aufgeteielt werden (das Complement System besteht aus Proteinen; siehe unten).

- Angeborenes IS
Das angeborene IS setzt sich aus sogenannten myeloiden Zellen zusammen, welche aus Granulozyten (Neutrophile, Basophile, Eosinophile), Mastzellen, dendritische Zellen und Monozyten (Vorläufer der Makrophagen) 'bestehen'. Wie der Name schon vermuten läßt ist dieses IS das Erste, welches Erreger erkennt und versucht zu bekämpfen. Weiterhin besitzt das angeborene IS kein Gedächtnis; in Form von Zellen.

- Adaptives IS
Dieses IS wird durch Lymphozyten charakterisiert und zeichnet sich dadurch aus, das es ein Gedächtnis besitzt (in Form von B- und T-Gedächtniszellen). Die Lymphozyten lassen sich in Natürliche Killerzellen, Natürliche Killer-T-Zellen, T-Zellen (CD4+ und CD8+) und B-Zellen (B1 und B2) unterteilen.

-Humorales IS
Zwischen dem zellulären und humoralen IS 'stehen' Zytokine, welche als Botenstoffe dienen.
Das humorale IS wird durch Antikörper (Immunglobuline) der Plasmazellen (ausdifferenzierte B-Zellen) vermittelt. Die sezernierten Immunglobuline (Ig) sind folgende (nach absteigenderHäufigkeit im Blutplasma sortiert): IgG, IgA, IgM, IgD und IgE. Diese Antikörper dienen der u. a. der Neutralisation und/oder Markierung von Eindringlingen. Nach dieser Markierung können die Erreger teilweise nicht mehr in ihre Zielzelle eindringen bzw. werden für die körpereigenen Freßzellen markiert. Auch dienen die Ig`s zur Aktivierung des Complement Systems.

-Complement System
Das Complement System (CS) ist mit ein Haupteffektor des humoralen IS und ebenso ein wichtiger Bestandteil des innaten (angeborenen) IS. Bestandteil dieses IS sind Proteine (C1 bis C9). Das CS besitzt 3 Möglichkeiten Erreger zu bekämpfen, die aber alle zu dem selbem Ziel (ab C5) führen: das Abtöten der Erreger.

--Möglichkeit 1:
Ausbildung eines membrane attack complex (MAC), der Poren in der Zielzelle ausbildet und somit zu deren Lyse ('Auslaufen' der Zelle) führt. Sies ist das Todesurteil für den Erreger.

-- Möglichkeit 2:
Markierung des Erregers für Freßzellen, welche den Eindringling internalisieren (Phagozytose) und dann 'verdauen'. Dieser Weg kann ab C3 verfolgt werden.

--Möglichkeit 3:
Die Stimulation von entzündungsfördernden Reaktionen. Hierdurch werden Leukozyten rekrutiert (herangeholt), welche dann die Erreger bekämpfen.


Entkommen, durch was auch immer für Mechanismen, die Erreger dem Immunsystem kann sich wohl jeder vorstellen, dass es nicht das Optimalste ist was einem passieren kann. Und es gibt (viele) Erreger, die im Laufe der Evolution Mechanismen entwickelt haben um dem Immunsystem zu entkommen. Vielleicht findet in irgendjemandem gerade eine statt... Beispiele darf sich jeder selber suchen über eine Suchmaschine seiner/ihrer Wahl... ;)


Falls Korrekturen nötig sind, können sie ja als Kommentar hinterlassen werden (ich bitte darum). Fragen versuche ich auch zu beantworten. 8)

Das Nebennieren-Karzinom

Tumore der Nebenniere sind Tumore, die mindestens 3% der Neoplasien von über 50 Jährigen ausmachen. Von diesen Raumforderungen stellt das Nebennieren-Karzinom (ACC) eine seltene (1-2 Fälle pro Million) und teilweise sehr bösartige Krankheit mit schlechter Prognose dar. Die Altersverteilung ist bimodal; es sind hauptsächlich Kinder und Menschen in ihrer 4 und 5 Lebens-Dekade betroffen. Ein vermehrtes ACC-Aufkommen ist bei Kindern in Süd-Brasilien zu beobachten. Generell scheinen Frauen etwas häufiger betroffen zu sein als Männer.

Aus molekularer Sicht läßt sich das ACC schlecht beschreiben, da eindeutige Marker leider nicht zur Verfügung stehen. Mehrere ACC zeigen Mutationen, die zur Inaktivierung des Tumorsuppressor-Proteins p53 führen. In vitro (also 'im Reagenzglas' und nicht im Körper) scheint auch die Überexpression des IGF-II (Insulin-ähnlicher Wachstums Faktor II) Proteins wichtig zu sein, welches über den IGF-I Rezeptor wachstumsfördernde Signale vermittelt. Weiterhin scheinen einige Karzinome einen allelischen Verlust des Differenzierungsfaktors ACTH zu zeigen, was eine Dedifferenzierung begünstigt. Nach operativer Entfernung des bösartigen Tumors stehen verschiedene Antikörper zur Evaluierung des potentiellen ACC zur Verfügung, die aber alle jedoch keine vollständige diagnostische Sicherheit zu geben in der Lage sind. In diesem Labor ist aber ein potentieller Marker in einem großen Set bestätigt worden, dessen Veröffentlichung in Arbeit ist. Außerdem scheint dessen Expressionsstärke mit schlechter Prognose zu korrelieren. Mehr aber nach der Veröffentlichung bzw. der erfolgreichen Annahme des Manuskriptes.

Klinische Präsentation der Patienten ist häufig durch die endokrine Aktivität des ACC gegeben. Bei endokrin inaktiven Tumoren sind es meist die durch die Raumforderung hervorgerufene Symptome (z. B. Druckgefühl), die zur Diagnose führen. Auch werden ACCs zufällig bei bildgebenden Untersuchungen 'entdeckt', welche dann als Inzidentalome bezeichnet werden.

Die momentan beste Therapie ist die vollständige chirurgische Entfernung des malignen Gewebes (inklusive von invadierten Gewebes; soweit möglich). Kann das Gewebe nicht komplett entfernt werden, könnte überlegt werden, das Gewebe nicht zu entfernen. Sehr wichtig ist auch, das die Tumor-Kapsel nicht beschädigt wird, damit nicht durch die resultierende Blutung der Tumor potentiell wiederkehren kann. Verbleiben Tumor-Reste des Primärgewebes bzw. nicht operierbare Metastasen, beträgt das Median-Überleben in den meisten Studien weniger als 12 Monate.

Neben dem operativen Eingriff existieren noch einige andere Möglichkeiten, die aber geringere Ansprechraten zeigen (ACCs können hohe Raten von Proteinen zeigen, die eine Resistenz gegen Medikamente zu vermitteln in der Lage sind). Zu diesen Alternativen gehören Bestrahlungen und medikamentöse Behandlungen, die jedoch teilweise mit für den Patienten unangenehmen Nebenwirkungen verbunden sind (Erbrechen etc). Die Medikamente können sowohl als Einzel- als auch Kombinationstherapie verabreicht werden.

Sehr wichtig ist auch das regelmäßige Follow-Up nach der Diagnose und bei folgenden und erfolgten Behandlungen, da Rekurrenz(en) zu befürchten sein können.

Spiegel Bericht 'Fremdartiges Leben Forscher suchen Überlebende der kosmischen Crashs'

Wie ich eben auf der Homepage des Spiegels las, gehen Forscher, wie z. B. Paul Davies, davon aus, dass das Leben auf unserem Himmelskörper auch mehrmals entstanden sein könnte; es hätte durchaus mehrmals mittels Meteoriten ausgelöscht sein worden sein.

Was sie aber leider nicht verraten ist, dass Paul Davies auch die Vermutung äußerte (in seinem Buch 'Das 5. Wunder Auf der Suche nach dem Ursprung des Lebens'), dass das Leben auch durch Meteoriten erst auf die Erde gebracht hätte sein können (Panspermie; siehe weiter unten). Erste Beweise, dass Bakterien die Aufprall-Geschwindigkeiten überleben können sind vollbracht [1]. Weiterhin sind wohl schon Mikroorganismen aus der Stratosphäre (41 km Höhe) isoliert worden [2]. Zusätzlich konnten schon zufällig von einer Mondlandung mit von der Erde und zurück gebrachte Einzeller 'wiederbelebt' werden (mit fehlt der Link).

In dem Artikel wird auch die Hypothese geäußert, das eventuell durch Meteroiten auf der Erde 'eingesäte' Lebensformen zu unseren Zuckern und Aminosäuren gespiegelte Nährstoffe verstoffwechseln könnten (das uns bekannte Leben benutzt L-Aminosäuren und D-Zucker). Damit wäre eine Koexistenz möglich, und die eine Art würde die Andere nicht in ihrem Lebensraum 'bedrohen'; es findet also keine Konkurrenz statt (läuten die Glocken aus dem Schul-Biologie-Unterricht?).

Warum sind also noch keine außerirdischen Lebewesen gefunden worden? Weil es Bakterien sackweise gibt (der Mensch atmet im Schnitt ca. 50 Bacillus Sporen ein) und keiner weiß wonach er suchen soll. Außerdem ist keine wirkliche Definition vorhanden, die Leben richtig definiert. In der Biologie gilt nur, das es sich selbst reproduzieren können, zu einer Interaktivität fähig und selbstständig lebensfähig sein muß (Frage: warum sind Viren demnach keine Lebewesen?).

Warum ich das hier schreib? - Weil es zwar Oftopic ist, aber dennoch interessant... :)


[1] http://www.rp-online.de/public/article/wissen/weltraum/60939/Wie-Mikroben-das-All-erobern.html
[2]http://www.berlinonline.de/berliner-zeitung/archiv/.bin/dump.fcgi/2002/1218/wissenschaft/0073/index.html

Wenn nichts funktioniert...

Mist,

der BD CBA Human Soluble Protein Flex Set System Assay hat nicht funktioniert... :(

Statt Detection Reagent Diluent (war leer) weiter das Capture Bead Reagent Diluent benutzt; Improvisation halt. Auch prompt versagt... Schade, da ich eingentlich keine (bewußten) Fehler gemacht hatte; auch mit anderer FACS-Vorlage (anderer Tag) nichts. Bei Proben nix, Standardreihe ebenso. *zensierter Ausdruck*

Eigentlich ist das ein ganz cooler Kit. Wenigstens funktionierte das 'normale' FACS; kleiner Trost am Abend. ;)

Update:
Mit dem Postdoc hat es dann doch einen Tag später funktioniert. Eigentlich hatte er das gleiche Vorgehen und Einstellungen wie ich; uneigentlich bzw. offensichtlicher Weise war es doch anders... *grmpf* Hauptsache Daten zum Auswerten! :)

Erste Einrichtungen dieses Blogs

So,

heute ist alles wesentliche zusammengewürfelt. Mal sehen was so alles rumkommt... :)