Immunhistochemie mit Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten Gewebe I

So, hier mal ein Immunhistochemie (IHC) -Protokoll, das als Antigen Retrieval (AR) die Protease Trypsin einsetzt. Die Gewebe sind Formalin-fixiert und Paraffin-eingebettet, was eine Lagerung von mehreren Jahrzehnten ermöglicht. Die Lagerung erfolgt natürlich möglichst unter kühlen und trockenen Bedingungen; sowie als Gesamtblock und nicht als einzelner Schnitt.

Hintergrund:
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Nachdem das entsprechende Gewebe mit Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet wurde, kann es bei Bedarf mittles eines Mikrotomes in Schnitte mit wenigen Mikrometer Dicke gebracht und auf Objektivträger überführt werden.

Bevor man mit diesen so für lange Zeit haltbar gemachten Gewebe arbeiten kann, muß zuerst das Wachs entfernt und der Schnitt rehydriert werden. Die Deparaffination wird mit dem Alkohol Xylen erreicht. Die Rehydrierung findet mittels 100 % Ethanol (EtOH) und mit aqua destillata (Aqua dest) verdünnten EtOH statt.

Das Trypsin verdaut (natürlich nach Deparaffination und Rehydrierung) teilweise die Gewebematrix bzw. das Gewebe und führt somit zur Verfügbarkeit des potentiellen Antigens. Das kann man sich in etwas so vorstellen, das die besagte Protease (ein solches Enzym 'zerschneidet' Proteine) Löcher in die Zellwand und in das innere der Zellen 'schneidet'. Durch dieses Löchern können dann die verwendeten Antikörper, Enzyme und weitere Substanzen in die Zellen eindringen.

Als nächstes findet die Hemmung der endogenen Peroxidase mittels 3 % Wasserstoffperoxidlösung (H2O2) in Methanol (MeOH) statt. Dies kann zu einer Reduktion des Hintergrundsignales bei der Farbentwicklung führen.

Bevor nun der Antikörper zugegeben wird, sollte noch möglichst ein Proteinblock mit einem dem verwendeten Gewebe entsprechendem Serum durchgeführt werden, was in einer Herabsetzung der unspezifischen Antikörperbindung resultieren kann.

Als nächstes wird der entsprechende Antikörper zugegeben und nach einer vorher bestimmten Inkubationszeit abgewaschen. Die Negativkontrolle dient natürlich zur Evaluation der Spezifität des Antikörpers. Gibt es bei Negativkontrolle ein Farbsignal habt Ihr nicht genug geblockt, unsauber gearbeitet, Antikörper 'verschleppt', der Antikörper ist nicht spezifisch usw.

Hiernach findet die Detektion des Antikörpers statt und es wird (mit dem System der Wahl) eine Farbgebung herbei geführt. Zum Schluß wird nur noch der Schnitt getrocknet und mit z. B. Entellan und einem Objektivträger eingedeckt.

Aber hier nun das Protokoll, welches etwas allgemein gehalten ist, da jeder seine Präferenzen hat. Fragt nach, oder benutzt eine Suchmaschine Eurer Wahl!

Protokoll:
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- Deparaffination für jeweils 10 min. in Xylol.

- Rehydrierung für jeweils 10 min. in EtOH und dessen Verdünnungen.

- AR mit 0.05 % Endkonzentration Trypsin (Dauer richtet sich häufig nach jeweiligem Antikörper und Firma) bei 37 °C. Ich inkubiere 10 min.

-Waschen mit Leitungswasser für 3 min. und kurzes Spülen mit aqua dest.

- Hemmung der endogenen Peroxidase mit 3 % H2O2 in MeOH für 10 min. bei Raumtemperatur (RT).

- Spülen mit Leitungswasser und aqua dest.

- Proteinblock für 1 Stunde bei RT (manche blocken garnicht, andere bevorzugen andere Inkubationszeiten. Testet es selber aus).

- Inkubation der Schnitte mit primärem Antikörper bzw. Negativkontrolle. (Optimale Inkubationszeit müßt Ihr selber austesten). Das Serum nur Abkippen. Das verbleibende Serum kann die Hintergrundfärbung verringern.

- Gut waschen mit PBS.

- Detektion des Antikörpers mit einem System Eurer Wahl. Ich benutze ein Peroxidase System aus Meerrettich(HRP), auf welches sich auch das weitere Vorgehen bezieht. Favorisiert Ihr ein Anderes müßt Ihr Euch selber schlau machen. :) 30 min. inkubieren bei RT.

- Gut waschen mit PBS.

- Substrat (DAB/Novared) für 10 min. bei RT.

- Waschen. Bei DAB erst Leitungswasser, dann aqua dest. Bei Novared nur aqua dest.

- Kernfärbung für 2 min. bei RT in Hämalaun nach Meyer.

- Bläuen für 5 min. in reichlich Leitungswasser. Soll die Farbe intensivieren (diese Aussage ist Glaubensfrage).

- Schnitte kurz in 100 % EtOH baden.

- Trocknen für ca. 20 min. bei 56 °C. 30 min. bei 37 °C reichen auch.

- Schnitte Eindecken.

Fertig!