Laborumzug I

So, der Laborumzug rückt immer näher. Alle sind teilweise bzw. mehr oder weniger gestresst. Ich hänge da zum Glück so gut wie garnicht drinnen... :) Aber es wird viel gestöhnt... Das kann etwas nervig sein.

In den Räumlichkeiten war ich auch noch nicht. Hatte immer was zu tun, wenn die Anderen dorthin aufgebrochen sind. Sollte das (k)ein Zufall sein... Verschwörungstheorien sind überall...

Aber ich weiß jetzt schon, was mir nicht paßt (sollte es tatsächlich so sein): man sitzt im Labor, und der Aufenthaltsraum soll relativ weit weg sein. Das ist doof, da ich zu den Leuten gehöre, die regelmäßig und relativ viel trinken (müssen), damit sie nicht ungehalten werden bzw. Kopfschmerzen bekommen bzw. denken können... Naja, mal sehen, was so wirklich bei rum kommt.

Und man darf Mitarbeiter-Schulungen machen. Das ist nicht verkehrt, weiß ich, da man dort hoffentlich ordentlich Infos bekommt. Im Moment ist es so, das viele nur wenig wissen. Naja...

DNA Isolation

Hier soll Euch kurz vorgestellt werden, wie man Deoxyribonukleinsäure (DNA) aus Gewebe isolieren und aufreinigen kann. Auch soll versucht werden die Hintergründe zu erklären.

Zuallererst: DNA ist ein Polyanion. Das heißt sie besitzt viele (poly) negative Ladungen (Anionen sind negativ geladene Moleküle).

Prinizipiell kann sie mittels 2 verschiedener Arten isoliert werden:

-- käuflich zu erwerbenes Kit (kann jeder),
-- nach selbst zusammengestellten Protokollen (kann auch jeder).

Ich persönlich finde die DNA-Isolierung durch nicht-Kits um einiges besser, da man doch eigentlich wissen sollte was man gerade anstellt bzw. was für Chemikalien man benutzt. Bei Kits schwebt man doch häufig in Unwissenheit...

Auch kann ich bei eigenen Protokollen händisch bestimmen was ich für Reagenzien einsetze, z. B. bin ich kein sonderlicher Freund des Chloroforms, Isoamylalkohol und ähnlichen organischen Schlonz. Sind ja nicht sonderlich gesundheitsfreundlich. ;)

Was also tun? Nach bißchen Literaturrecherche kann man sehr simple Protokolle finden, die sich natürlich auch kombinieren lassen. Diese dann austesten muß/sollte man natürlich auch (wie ist Ausbeute, Reinheit, etc.).

Zum Beispiel läßt sich DNA flugs mittels Natronlauge (NaOH), schnödes Kochsalz (NaCl), Ethanol (EtOH) und Isopropylalkohol aus Gewebe isolieren und aufreinigen. Kurz gefasst:

-- Gewebe mittels NaOH zerstören bei 100 °C.
-- Kurzzeitiges Abkühlen der Lösung auf Eis.
-- Proteine aussalzen mit NaCl. Hier werden die Proteine über die Salzionen verbunden und können abzentrifugiert werden.
-- DNA mit Isopropylalkohol fällen. Der Alkohol verdrängt die Wassermoleküle, so daß die positiven Salzionen (Na+) kovalente Bindungen (statt der sonst nur Ionischen) mit den Sauerstoffatomen der Phosphate ausbilden können und die Nukleinsäure somit elektrisch neutralisiert wird und ausfällt. Man kann auch für minimal 1 h bei -20 °C fällen. Dies kann zu erhöhter Ausbeute führen.
-- Abzentrifugieren der Nukleinsäure.
-- Waschen mit 100 % EtOH.
-- Waschen mit 75 % EtOH (die beiden Waschschritte entfernen unnötige Salze).
-- Abzentrifugieren.
-- Das Pellet für 10-15 min. bei 37 °C trocknen. Nicht übertrockenen!
-- Pellet in einem geeignetem Volumen aufnehmen. Manche favorisieren Wasser, Andere Tris-EDTA (TE) -Puffer. Vorteil des Puffers ist, das die DNA länger stabil bleiben sollte.
-- Lagerung der Nukleinsäure. Kurzfristig bei - 20 °C, Langzeit bei -80 °C.

Die Reinheit der DNA sollte zwischen 1.8 und 2.0 liegen (Extinktion von 260/280) und auch bei 260/230. Ersteres gibt proteinale Verunreinigungen an, zweiteres welche durch Kohlenhydrate.

So, viel Spaß hiermit und beim Austesten eigener Protokolle! :)

Polymerasekettenreaktion einfach erklärt

Nachdem die Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction; PCR) durch das Heilbronner Phantom in - mehr oder weniger - aller Munde ist, möchte ich hier mal erklären, was es mit dieser tollen Methode auf sich hat.

Die Grundlage der PCR ist das Vorhandensein von Deoxyribonukleinsäure (DNA). Mit DNA als Substrat kann mittels spezifischen Primern (diese geben den Start- und Endbereich des zu amplifizierenden [verfielfältigenden] Bereiches der PCR-Reaktion an. Auch bei den Primern handelt es sich um kurze Sequenzen von Nukleinsäure) ein bestimmter Bereich der DNA vervielfältigt werden. Dies ist möglich, da die Primer nur an ihnen komplementären (d.h. ähnlichen) Bereichen binden (das sogenannte Annealing). Die Spezifität des Annealing wird duch die Primer-spezifische Annealing-Temperatur (Tm) ermöglicht. Die Tm wiederum ergibt sich aus der jeweiligen Sequenz des Primers. Mit einem speziellen Gerät, der PCR (-Maschine) kann nun z. B. überprüft werden, ob durch die Primer definierte DNA-Abschnitte vorhanden sind.

Wie funktioniert dies aber genau??? - Das ist (relativ) einfach.

Doppelsträngige DNA (dsDNA; siehe Abbildung) setzt sich aus vier an Zucker (Deoxyribose) gebundene Basen zusammen: Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin. Diese Nukleoside werden dann (Deoxy-) Adenosin (A), (Deoxy-) Guanosin (G), (Deoxy-) Cytidin (C) und (Deoxy-) Thymidin (T) genannt. Das Rückgrat der DNA besteht aber aus Zucker-Phosphat (die gewundenen 'Bänder' in der Abbildung). Die 'nun' phosphorylierten Nukleoside werden Nukleotide (hier nicht gezeigt) genannt. Lagern sich jeweils einzelne (ss) zueinander komplementäre DNA-Stränge aneinander, resultiert dsDNA (die Gesamtstruktur in der Abbildung). Die einzelnen Basen bilden dann Paare aus, und zwar immer A mit T und G mit C (siehe Abbildung).

Eine DNA-Polymerase ist ein Enzym (ein Protein, das als Katalysator dient), welches in der Lage ist DNA zu amplifizieren. Allerdings brauchen DNA-Polymerasen ein schon vorhandenes DNA-Ende um ihre Funktion auszuüben bzw. überhaupt zu beginnen. Fehlt dies kann sie ihre Arbeit nicht ausführen. Diese Enzyme besitzen alle Lebewesen. Für die PCR werden meist Proteine aus bestimmten thermophilen (hitzeliebende) Bakterien benutzt, da diese die hohen Temperaturen, die bei der PCR zutrage kommen, 'verkraften'.

Ein PCR-Ansatz setzt sich aus folgenden Bestandteilen zusammen: DNA, Deoxynukleotide (dNTPs), destilliertes Wasser, Primer, eine Polymerase und ein der Polymerase entsprechendes Puffersystem. Als erstes wird die dsDNA zu ssDNA durch hohe Temperaturen (95 °C) 'aufgeschmolzen'. Durch das Absenken der Temperatur auf die Tm können sich die Primer an ihnen komplementären Bereichen anlagern. Durch die annealten Primer ist die Polymerase in der Lage diese bestimmten Bereiche zu vervielfältigen. Die Amplifikation geschieht meist bei 72 °C (die Extensionsphase), ist aber auch von der Polymerase selbst abhängig (je nachdem welche Temperatur für sie optimal ist). Durch das mehrmalige Wiederholen dieses Vorganges kann aus sehr wenig vorliegender DNA ein 'gutes Stück Material' erhalten werden, welches zur Sequenzierung (Bestimmung der T, G, A und C Abfolge) verwendet werden kann.

Bei einer guten PCR wird eigentlich immer eine Negativkontrolle mit verwendet. Diese Kontrolle enthält alles außer der DNA (bei selben Volumen des Ansatzes) und dient der Bestimmung, ob sich irgendwo Verunreinigungen eingeschlichen haben. Die Differenz aus fehlender DNA wird mit destillierten Wasser ausgeglichen. Die Negativkontrolle ist im Optimalfall selbstredend negativ.

Zu beachten ist, das man nicht zuviel DNA und zuwenig Primer zugibt. Dies führt dazu, das die Primer bei späteren Zyklen nicht mehr für die PCR verfügbar sind; sie haben sich ja schon an die DNA angelagert und stehen somit späteren amplifizierten Produkten nicht mehr zur Verfügung. Somit findet keine/kaum noch Amplifizierung statt. Für gewöhnlich setzt man 10-100 ng DNA pro Ansatz ein. Auch sind zuviele dNTPs der PCR nicht zuträglich, da sie die Polymerase inhibieren können. 20-50 pmol beider Primer sind gewöhnlich ausreichend. Eine zu großzügig gewählte Anzahl an Zyklen ist auch unerwünscht, da man Gefahr laufen kann 'Schrott' (oder alles andere außer dem Gewünschten) zu amplifizieren. Als Startzahl genügen 30-35 Zyklen. Mehr als 45 Zyklen sollte man sich überlegen. Zuviel Polymerase ist auch unsinnig, da man so den gefürchteten Schmier (abgebrochene Transkripte) begünstigt. Weniger an Enzym ist meist mehr. Weiterhin kann die PCR mit Zusätzen wie z. B. Rinderserumalbumin (BSA), Mg++ Ionen und Dimethylsulfoxid (DMSO) optimiert werden. Das BSA kann die Wände der Reaktionsgefäße auskleiden, so daß die Polymerase nicht an den Wänden bindet und somit der PCR-Reaktion zur Verfügung steht. Die Mg++ Ionen beinflussen das Primer-Annealing ('überbrücken' der negativen Ladungen der polyanionischen Nukleinsäuren), das Denaturierungsverhalten der DNA (selbige Grund wie eben), die Enzymaktivität (Enzyme sind meist Mg++ abhängig), die Genauigkeit und können Primer-Dimer Artefakte begünstigen (siehe Ladung). Ebenso können sie das unspezifische Binden von Primern begünstigen. Das DMSO fördert das Denaturieren der DNA. DMSO ist wie DNA negativ geladen. Es kann somit das Schmelzverhalten der DNA beinflussen, was sich positiv auf die Amplifikation von GC-reichen Sequenzen ausüben kann. Weiterhin destabilisiert DMSO auch ein wenig das Enzym.

So, ich hoffe ich konnte etwas die PCR erklären bzw. paar Tips geben. Wie immer: ihr könnt die Kommentare nutzen...

Quelle des Bildes: http://www.medizin.uni-tuebingen.de/webim2/moldiag/bilder/dna.jpg

Immunhistochemie (IHC) Etablierung

So, nachdem es so scheint, das die IHC für den benutzten Antikörper etabliert ist, wurden auch schon die ersten Nebennieren-Karzinome (ACC) gefärbt. Nix... Leider sind es auch keine so wundervollen Schnitte. Sie bestehen hauptsächlich aus Fett- bzw. Stroma-Gewebe und dies ist halt negativ für das Antigen (auch in der Literatur ;) ).

Antigen Retrieval mache ich hier mit Trypsin bei 37 °C. Citratmonohydrat-Puffer (pH 6) und Hitze (Druckkochtopf; 10 und 20 min.) läßt die Schnitte fast wie eine 'Milka-Kuh' aussehen. Und das ist ziemlich uncool... Mit Protease ist aber alles gut. Auch kann man ordentliche Verdünnung (1:1000) benutzen. *g*

Wenigstens waren Positiv- und Negativkontrollen so wie sie sein sollten... :)

Außerdem ist die Gegenfärbung voll für den *****. Mal neues Hämalaun nach Mayer benutzen.

Bei Gelegenheit schreibe ich welche Protokolle ich (momentan) benutze.

In diesem Sinne!

Überblick über das Immunsystem

Heute soll hier eine kurze Einführung über das Immunsystem auftauchen. Was die jeweiligen Zellen so bewirken (können) soll zu einer anderen Zeit hier erscheinen.

Das Immunsystem (IS) kann folgend unterteilt werden:
- zelluläres IS
- humorales IS
- Complement System.

Immunität wird durch Leukozyten vermittelt, die in Zellen des angeborenen IS und des adaptiven IS aufgeteielt werden (das Complement System besteht aus Proteinen; siehe unten).

- Angeborenes IS
Das angeborene IS setzt sich aus sogenannten myeloiden Zellen zusammen, welche aus Granulozyten (Neutrophile, Basophile, Eosinophile), Mastzellen, dendritische Zellen und Monozyten (Vorläufer der Makrophagen) 'bestehen'. Wie der Name schon vermuten läßt ist dieses IS das Erste, welches Erreger erkennt und versucht zu bekämpfen. Weiterhin besitzt das angeborene IS kein Gedächtnis; in Form von Zellen.

- Adaptives IS
Dieses IS wird durch Lymphozyten charakterisiert und zeichnet sich dadurch aus, das es ein Gedächtnis besitzt (in Form von B- und T-Gedächtniszellen). Die Lymphozyten lassen sich in Natürliche Killerzellen, Natürliche Killer-T-Zellen, T-Zellen (CD4+ und CD8+) und B-Zellen (B1 und B2) unterteilen.

-Humorales IS
Zwischen dem zellulären und humoralen IS 'stehen' Zytokine, welche als Botenstoffe dienen.
Das humorale IS wird durch Antikörper (Immunglobuline) der Plasmazellen (ausdifferenzierte B-Zellen) vermittelt. Die sezernierten Immunglobuline (Ig) sind folgende (nach absteigenderHäufigkeit im Blutplasma sortiert): IgG, IgA, IgM, IgD und IgE. Diese Antikörper dienen der u. a. der Neutralisation und/oder Markierung von Eindringlingen. Nach dieser Markierung können die Erreger teilweise nicht mehr in ihre Zielzelle eindringen bzw. werden für die körpereigenen Freßzellen markiert. Auch dienen die Ig`s zur Aktivierung des Complement Systems.

-Complement System
Das Complement System (CS) ist mit ein Haupteffektor des humoralen IS und ebenso ein wichtiger Bestandteil des innaten (angeborenen) IS. Bestandteil dieses IS sind Proteine (C1 bis C9). Das CS besitzt 3 Möglichkeiten Erreger zu bekämpfen, die aber alle zu dem selbem Ziel (ab C5) führen: das Abtöten der Erreger.

--Möglichkeit 1:
Ausbildung eines membrane attack complex (MAC), der Poren in der Zielzelle ausbildet und somit zu deren Lyse ('Auslaufen' der Zelle) führt. Sies ist das Todesurteil für den Erreger.

-- Möglichkeit 2:
Markierung des Erregers für Freßzellen, welche den Eindringling internalisieren (Phagozytose) und dann 'verdauen'. Dieser Weg kann ab C3 verfolgt werden.

--Möglichkeit 3:
Die Stimulation von entzündungsfördernden Reaktionen. Hierdurch werden Leukozyten rekrutiert (herangeholt), welche dann die Erreger bekämpfen.


Entkommen, durch was auch immer für Mechanismen, die Erreger dem Immunsystem kann sich wohl jeder vorstellen, dass es nicht das Optimalste ist was einem passieren kann. Und es gibt (viele) Erreger, die im Laufe der Evolution Mechanismen entwickelt haben um dem Immunsystem zu entkommen. Vielleicht findet in irgendjemandem gerade eine statt... Beispiele darf sich jeder selber suchen über eine Suchmaschine seiner/ihrer Wahl... ;)


Falls Korrekturen nötig sind, können sie ja als Kommentar hinterlassen werden (ich bitte darum). Fragen versuche ich auch zu beantworten. 8)

Das Nebennieren-Karzinom

Tumore der Nebenniere sind Tumore, die mindestens 3% der Neoplasien von über 50 Jährigen ausmachen. Von diesen Raumforderungen stellt das Nebennieren-Karzinom (ACC) eine seltene (1-2 Fälle pro Million) und teilweise sehr bösartige Krankheit mit schlechter Prognose dar. Die Altersverteilung ist bimodal; es sind hauptsächlich Kinder und Menschen in ihrer 4 und 5 Lebens-Dekade betroffen. Ein vermehrtes ACC-Aufkommen ist bei Kindern in Süd-Brasilien zu beobachten. Generell scheinen Frauen etwas häufiger betroffen zu sein als Männer.

Aus molekularer Sicht läßt sich das ACC schlecht beschreiben, da eindeutige Marker leider nicht zur Verfügung stehen. Mehrere ACC zeigen Mutationen, die zur Inaktivierung des Tumorsuppressor-Proteins p53 führen. In vitro (also 'im Reagenzglas' und nicht im Körper) scheint auch die Überexpression des IGF-II (Insulin-ähnlicher Wachstums Faktor II) Proteins wichtig zu sein, welches über den IGF-I Rezeptor wachstumsfördernde Signale vermittelt. Weiterhin scheinen einige Karzinome einen allelischen Verlust des Differenzierungsfaktors ACTH zu zeigen, was eine Dedifferenzierung begünstigt. Nach operativer Entfernung des bösartigen Tumors stehen verschiedene Antikörper zur Evaluierung des potentiellen ACC zur Verfügung, die aber alle jedoch keine vollständige diagnostische Sicherheit zu geben in der Lage sind. In diesem Labor ist aber ein potentieller Marker in einem großen Set bestätigt worden, dessen Veröffentlichung in Arbeit ist. Außerdem scheint dessen Expressionsstärke mit schlechter Prognose zu korrelieren. Mehr aber nach der Veröffentlichung bzw. der erfolgreichen Annahme des Manuskriptes.

Klinische Präsentation der Patienten ist häufig durch die endokrine Aktivität des ACC gegeben. Bei endokrin inaktiven Tumoren sind es meist die durch die Raumforderung hervorgerufene Symptome (z. B. Druckgefühl), die zur Diagnose führen. Auch werden ACCs zufällig bei bildgebenden Untersuchungen 'entdeckt', welche dann als Inzidentalome bezeichnet werden.

Die momentan beste Therapie ist die vollständige chirurgische Entfernung des malignen Gewebes (inklusive von invadierten Gewebes; soweit möglich). Kann das Gewebe nicht komplett entfernt werden, könnte überlegt werden, das Gewebe nicht zu entfernen. Sehr wichtig ist auch, das die Tumor-Kapsel nicht beschädigt wird, damit nicht durch die resultierende Blutung der Tumor potentiell wiederkehren kann. Verbleiben Tumor-Reste des Primärgewebes bzw. nicht operierbare Metastasen, beträgt das Median-Überleben in den meisten Studien weniger als 12 Monate.

Neben dem operativen Eingriff existieren noch einige andere Möglichkeiten, die aber geringere Ansprechraten zeigen (ACCs können hohe Raten von Proteinen zeigen, die eine Resistenz gegen Medikamente zu vermitteln in der Lage sind). Zu diesen Alternativen gehören Bestrahlungen und medikamentöse Behandlungen, die jedoch teilweise mit für den Patienten unangenehmen Nebenwirkungen verbunden sind (Erbrechen etc). Die Medikamente können sowohl als Einzel- als auch Kombinationstherapie verabreicht werden.

Sehr wichtig ist auch das regelmäßige Follow-Up nach der Diagnose und bei folgenden und erfolgten Behandlungen, da Rekurrenz(en) zu befürchten sein können.