Protokoll für FISH mit selbstgebastelten Sonden

Wie unten angekündigt hier das FISH Protokoll für selbstgebastelte Sonden auf/für Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete Gewebe (FFPE). Ebenfalls ist unten beschrieben wie wir die Sonden bastelten.

Protokoll:

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- Heizplatte und Pepsin-Lösung auf 80°C und 37 °C vorwärmen.

- FFPE Schnitte für eine Stunde auf der Heizplatte inkubieren.

- 2x 10 Minuten in 100% Xylen bei Raumtemperatur (RT) inkubieren und anschließend jeweils 5 Minuten in 100%, 90% und 70% Ethanol (EtOH).

- Schnitte 5 Minuten in 1x PBS waschen, 5 Minuten in einem Schnellkochtopf kochen und 20 Minuten abkühlen lassen.

- Schnitte 5 Minuten in 1x PBS waschen und 1 Stunde in RNase-Lösung bei 37 °C inkubieren.

- Schnitte in 2x SSC waschen und für 70 Minuten bei 37 °C die Kern-Membran mit Pepsin-Lösung verdauen.

- Mit 1x PBS für 5 Minuten bei RT waschen und die Dehydrisierung für jeweils 5 Minuten mit 70%, 90% und 100% EtOH durchführen, gefolgt von einer 15 minütigen Trocknung bei 37 °C.

- Sonden-Lösung (10µl) mittig auf die Schnitte pipettieren, ein Deckgläschen blasenfrei auflegen, die Ränder mit Fixogum versiegeln und die DNA denaturieren bei 80 °C für 10 Minuten.

- Inkubation über Nacht bei 37 °C in einer Feuchtekammer.

- Am nächsten Morgen wird das Fixogum vorsichtig entfernt und die Schnitte 2x in 2x SSC bei RT gewaschen.

- Schnitte 3x 3 Minuten bei 73 °C in Waschlösung waschen, gefolgt von einem blocking step mit 200 µl TNB Puffer pro Schnitt für 45 Minuten bei 37 °C in einer Feuchtekammer.

- Inkubation bei 37 °C in einer Feuchtekammer für 30 Minuten mit 2 µl Fluorescein-Avidin-DCS in 200 µl TNB Puffer.

- 2x waschen mit 1x TNT Puffer bei RT und die Schnitte dehydrieren für jeweils 4 Minuten in 70%, 90%, 100% EtOH bei RT.

- Schnitte für 10-15 Minuten bei 37 °C trocknen, 1 Tropfen Vectashield mit DAPI auf die Schnitte geben und mit einem Deckgläschen abdecken.

Fertig!

Selbstgebastelte Sonden für FISH

Hier ein Protokoll zum selberbasteln für FISH Sonden. Als erstes muß die Grundlage des Versuches geschaffen werden, das Sondenbasteln an sich. Hierfür können Vektoren gekauft werden (in Bakterien-Stämmen), die das gewünschte Gensegment bzw. den chromosomalen Bereich umfassen. Nach Anzucht der Stämme und Isolierung der Plasmide (händisch bzw. per Kit und Konzentrationsbestimmung der Plasmid-DNA) kann losgelegt werden.

Ich hatte für das Sondenbasteln ein Kit benutzt, und zwar das Biotin-16-dUTP 5' dNTP Kit von Roche nach deren Protokoll. Hierbei werden 1 µg template DNA auf ein Volumen von 16 µl gebracht (mit Aqua destillata) und 4 µl Biotin-Nick Translation Mix zugegeben, gemixt und kurz abzentrifugiert. Anschließend wird eine 90 minütige Inkubation bei 15 °C durchgeführt und die Reaktion durch Zugabe von 1 µl EDTA-Lösung gestoppt und die Enzyme durch eine 10 minütige Inkubation bei 65 °C inaktiviert. Im Anschluß wird eine Gel-Elektrophorese durchgeführt (mit 3 µl Assay) um zu überprüfen, ob die enzymatisch generierten Plasmid-DNA Fragmente eine Größe von 200-500 Nukleotide haben. Ist dies nicht der Fall muss erneut inkubiert werden, ansosnten wird die DNA aufgereinigt (per Hand oder Kit) und die FISH-Analyse kann durchgeführt werden (folgt später).

Auch können die Sonden komplett selbst gebastelt werden, was ich eventuell in einem späteren Post beschreiben werde.

Endlich abgegeben

*Juhu*

Endlich ist seit ca. 2 Monaten die Doktor-Arbeit abgegeben. Jetzt heißt es leider noch warten bis ich den Verteidigungs-Vortrag halten kann. Werde wohl mal die Tage im Dekanat nachfragen.

Auch sollte jetzt mal wieder etwas mehr Bewegung hier reinkommen, z.B. paar Dinge posten, die ich schon länger vorhatte. Das aber erst die Tage. :)

Eine kurze Einführung in (fluoreszierender) in situ Hybridisierung ((fluorescent) in situ hybridization; (F)ISH)

Bei dieser Methode handelt es sich um eine Technik mit derer z. B. Genduplikationen oder -deletionen (oder einfach 'nur' eine Verhäufigung einer bestimmten DNA-Sequenz) in Zellkernen von Geweben (in situ bedeutet eigentlich 'am Platz/Ort', also salop 'am Ort des Geschehens') nachgewiesen werden können. Inzwischen existieren mannigfalte Variationen, die aber (für gewöhnlich) dieselbe Grundage haben. Worum geht es also bei dieser äußerst 'abgefahrenen' (zumindest meiner Meinung nach) Methode?

Die ersten in situ Techniken basierten auf autoradiographischer Detektion von Nukleinsäuresequenzen, die ein hohe Häufigkeit zeigten, wie z. B. die sich wiederholenden Sequenzen bei Metaphasen-Chromosomen. Um die mit Strahlung verbundenden Nachteile zu umgehen (bspw. zeitaufwändig, spezielle Handhabung der radioaktiven Stoffe), wurden nicht-radioaktive Vorgehen entwickelt. Zwei Beispiele seien Avidin-Biotin Systeme (beides Proteine, wobei initial das sekundär zugegebene Avidin das primäre verwante Biotin erkennt. Auch Kaskaden lassen sich so 'schalten') und direkte Markierung von DNA mit Fluorophoren (chemische Stoffe, die bei Anregung mit Licht von entsprechender Wellenlänge z. B. grün, rot, etc. 'leuchten'). Seit ungefähr 2 bis 3 Dekaden ist auch bekannt, das synthetische, einzelsträngige DNA, die als 'Sonde' dient, zur Erkennung ihrer komplementären DNA-Sequenz eingesetzt werden kann (natürlich sollte diese 'markiert' sein, um ein Signal zu erhalten).

Die in situ Hybridisierung kann in 3 systematische Teile untergliedert werden.
1.) Die Zielsequenz muß in einen Zustand gebracht werden, der sie zugänglich für die Sonde macht.
2.) Hochgradig spezifische Erkennung der Sonde und ihrer Zielsequenz. Weiterhin darf bzw. sollte möglichst wenig unspezifische Bindung der Sonde an z. B. Gewebe, nicht-komplementäre DNA usw. stattfinden.
3.) Die Sonde selbst muss gnauestens nachgewiesen werden. Auch hier mit möglichst wenig unspezifischer Bindung.
Dargestellt sind die 3 Punkte in der folgenden Abbildung, die ich von http://www.ivfsurrogacy.com im Juni 2010 runterlud.

LaTeX Layout Doktorarbeit

Boah,

irgendwie hat mir das Packet abstract (inkl. tabbing) in meinem ausgelagerten Packet Packet, Dateiendung .sty, Packete Einbinden mit \RequirePackage{}, das selbstgebastelte Seitenlayout (mit fancyhdr) zerlegt. Mit koma-script lief es auch nicht... Lief auf Windows (Compi in Uni; Miktex) und meinen privaten BSDs nicht.

Jetzt ist alles gut. Packet abstract verbannt, Abstrakte mit \chapter*{} und \thispagestyle{empty} generiert und Abkürzungsverzeichnis in Anhang (\RequirePackage[toc, page]{appendix}) verlegt. *JUHU*

Vielleicht haue ich hier mal die besagte Layout-Vorlage hier rein...

Paperschreiben

Hm, ich muß gestehen, das mich beim Schreiben des Paper-Rohgerüsts durchaus
sowas wie Spaß an der Sache überkommt... :)


Außerdem kann man so schön das Englische üben. Soll ja Vorteile haben... :p