Die Antigen Retrieval Methode hier ist nun die Mikrowelle. Für eine Hintergrund-Beschreibung der Immunhistochemie (IHC) siehe das vorherige Posting. :)
Protokoll:
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- Deparaffination für jeweils 10 min. in Xylol.
- Rehydrierung für jeweils 10 min. in EtOH und dessen Verdünnungen.
- AR mit einer Mikrowelle. Schnitte in 10 mM Citratmonohydrat-Puffer pH6 2x 5 min. aufkochen. Zwischen den Schritten verdunsteten Puffer nachfüllen.
- Ca. 25 min. abkühlen lassen.
- 5x Spülen mit aqua dest.
- Hemmung der endogenen Peroxidase mit 3 % H2O2 in MeOH für 10 min. bei Raumtemperatur (RT).
- Spülen mit Leitungswasser und aqua dest.
- Proteinblock für 1 Stunde bei RT (manche blocken garnicht, andere bevorzugen andere Inkubationszeiten. Testet es selber aus).
- Inkubation der Schnitte mit primärem Antikörper bzw. Negativkontrolle. (Optimale Inkubationszeit müßt Ihr selber austesten). Das Serum nur Abkippen. Das verbleibende Serum kann die Hintergrundfärbung verringern.
- Gut waschen mit PBS.
- Detektion des Antikörpers mit einem System Eurer Wahl. Ich benutze ein Peroxidase System aus Meerrettich(HRP), auf welches sich auch das weitere Vorgehen bezieht. Favorisiert Ihr ein Anderes müßt Ihr Euch selber schlau machen. :) 30 min. inkubieren bei RT.
- Gut waschen mit PBS.
- Substrat (DAB/Novared) für 10 min. bei RT.
- Waschen. Erst Leitungswasser, dann aqua dest.
- Kernfärbung für 2 min. bei RT in Hämalaun nach Meyer.
- Bläuen für 5 min. in reichlich Leitungswasser. Soll die Farbe intensivieren (diese Aussage ist Glaubensfrage).
- Schnitte kurz in 100 % EtOH baden.
- Trocknen für ca. 20 min. bei 56 °C. 30 min. bei 37 °C reichen auch.
- Schnitte Eindecken.
Fertig!
vor 12 Jahren
