Nachdem die Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction; PCR) durch das Heilbronner Phantom in - mehr oder weniger - aller Munde ist, möchte ich hier mal erklären, was es mit dieser tollen Methode auf sich hat.
Die Grundlage der PCR ist das Vorhandensein von Deoxyribonukleinsäure (DNA). Mit DNA als Substrat kann mittels spezifischen Primern (diese geben den Start- und Endbereich des zu amplifizierenden [verfielfältigenden] Bereiches der PCR-Reaktion an. Auch bei den Primern handelt es sich um kurze Sequenzen von Nukleinsäure) ein bestimmter Bereich der DNA vervielfältigt werden. Dies ist möglich, da die Primer nur an ihnen komplementären (d.h. ähnlichen) Bereichen binden (das sogenannte Annealing). Die Spezifität des Annealing wird duch die Primer-spezifische Annealing-Temperatur (Tm) ermöglicht. Die Tm wiederum ergibt sich aus der jeweiligen Sequenz des Primers. Mit einem speziellen Gerät, der PCR (-Maschine) kann nun z. B. überprüft werden, ob durch die Primer definierte DNA-Abschnitte vorhanden sind.
Wie funktioniert dies aber genau??? - Das ist (relativ) einfach.
Doppelsträngige DNA (dsDNA; siehe Abbildung) setzt sich aus vier an Zucker (Deoxyribose) gebundene Basen zusammen: Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin. Diese Nukleoside werden dann (Deoxy-) Adenosin (A), (Deoxy-) Guanosin (G), (Deoxy-) Cytidin (C) und (Deoxy-) Thymidin (T) genannt. Das Rückgrat der DNA besteht aber aus Zucker-Phosphat (die gewundenen 'Bänder' in der Abbildung). Die 'nun' phosphorylierten Nukleoside werden Nukleotide (hier nicht gezeigt) genannt. Lagern sich jeweils einzelne (ss) zueinander komplementäre DNA-Stränge aneinander, resultiert dsDNA (die Gesamtstruktur in der Abbildung). Die einzelnen Basen bilden dann Paare aus, und zwar immer A mit T und G mit C (siehe Abbildung).
Eine DNA-Polymerase ist ein Enzym (ein Protein, das als Katalysator dient), welches in der Lage ist DNA zu amplifizieren. Allerdings brauchen DNA-Polymerasen ein schon vorhandenes DNA-Ende um ihre Funktion auszuüben bzw. überhaupt zu beginnen. Fehlt dies kann sie ihre Arbeit nicht ausführen. Diese Enzyme besitzen alle Lebewesen. Für die PCR werden meist Proteine aus bestimmten thermophilen (hitzeliebende) Bakterien benutzt, da diese die hohen Temperaturen, die bei der PCR zutrage kommen, 'verkraften'.
Ein PCR-Ansatz setzt sich aus folgenden Bestandteilen zusammen: DNA, Deoxynukleotide (dNTPs), destilliertes Wasser, Primer, eine Polymerase und ein der Polymerase entsprechendes Puffersystem. Als erstes wird die dsDNA zu ssDNA durch hohe Temperaturen (95 °C) 'aufgeschmolzen'. Durch das Absenken der Temperatur auf die Tm können sich die Primer an ihnen komplementären Bereichen anlagern. Durch die annealten Primer ist die Polymerase in der Lage diese bestimmten Bereiche zu vervielfältigen. Die Amplifikation geschieht meist bei 72 °C (die Extensionsphase), ist aber auch von der Polymerase selbst abhängig (je nachdem welche Temperatur für sie optimal ist). Durch das mehrmalige Wiederholen dieses Vorganges kann aus sehr wenig vorliegender DNA ein 'gutes Stück Material' erhalten werden, welches zur Sequenzierung (Bestimmung der T, G, A und C Abfolge) verwendet werden kann.
Bei einer guten PCR wird eigentlich immer eine Negativkontrolle mit verwendet. Diese Kontrolle enthält alles außer der DNA (bei selben Volumen des Ansatzes) und dient der Bestimmung, ob sich irgendwo Verunreinigungen eingeschlichen haben. Die Differenz aus fehlender DNA wird mit destillierten Wasser ausgeglichen. Die Negativkontrolle ist im Optimalfall selbstredend negativ.
Zu beachten ist, das man nicht zuviel DNA und zuwenig Primer zugibt. Dies führt dazu, das die Primer bei späteren Zyklen nicht mehr für die PCR verfügbar sind; sie haben sich ja schon an die DNA angelagert und stehen somit späteren amplifizierten Produkten nicht mehr zur Verfügung. Somit findet keine/kaum noch Amplifizierung statt. Für gewöhnlich setzt man 10-100 ng DNA pro Ansatz ein. Auch sind zuviele dNTPs der PCR nicht zuträglich, da sie die Polymerase inhibieren können. 20-50 pmol beider Primer sind gewöhnlich ausreichend. Eine zu großzügig gewählte Anzahl an Zyklen ist auch unerwünscht, da man Gefahr laufen kann 'Schrott' (oder alles andere außer dem Gewünschten) zu amplifizieren. Als Startzahl genügen 30-35 Zyklen. Mehr als 45 Zyklen sollte man sich überlegen. Zuviel Polymerase ist auch unsinnig, da man so den gefürchteten Schmier (abgebrochene Transkripte) begünstigt. Weniger an Enzym ist meist mehr. Weiterhin kann die PCR mit Zusätzen wie z. B. Rinderserumalbumin (BSA), Mg++ Ionen und Dimethylsulfoxid (DMSO) optimiert werden. Das BSA kann die Wände der Reaktionsgefäße auskleiden, so daß die Polymerase nicht an den Wänden bindet und somit der PCR-Reaktion zur Verfügung steht. Die Mg++ Ionen beinflussen das Primer-Annealing ('überbrücken' der negativen Ladungen der polyanionischen Nukleinsäuren), das Denaturierungsverhalten der DNA (selbige Grund wie eben), die Enzymaktivität (Enzyme sind meist Mg++ abhängig), die Genauigkeit und können Primer-Dimer Artefakte begünstigen (siehe Ladung). Ebenso können sie das unspezifische Binden von Primern begünstigen. Das DMSO fördert das Denaturieren der DNA. DMSO ist wie DNA negativ geladen. Es kann somit das Schmelzverhalten der DNA beinflussen, was sich positiv auf die Amplifikation von GC-reichen Sequenzen ausüben kann. Weiterhin destabilisiert DMSO auch ein wenig das Enzym.
So, ich hoffe ich konnte etwas die PCR erklären bzw. paar Tips geben. Wie immer: ihr könnt die Kommentare nutzen...
Quelle des Bildes: http://www.medizin.uni-tuebingen.de/webim2/moldiag/bilder/dna.jpg
